Молекулярные механизмы замедления старения кожи под действием гидролизата плаценты человека.

Статистическая обработка данных включала подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки (Statistica 7.0). Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро–Уилка (W-test). Было установлено, что все выборки соответствуют нормальному распределению.

Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала–Уоллиса). Для выборок, а которых разброс был значительным, применяли процедуры множественных сравнений с помощью критерия Манна–Уитни. Для групп с незначительным разбросом применяли t-критерий Стьюдента. Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,01.

Результаты и обсуждение

При анализе данных об относительной площади экспрессии изучаемых маркеров в «молодой культуре» фибробластов человека на 3-м пассаже было установлено увеличение показателей экспрессии маркеров Ki-67, кальретикулина, сиртуина-6 и синтаксина под воздействием препарата Мэлсмон (рис. 1). Наиболее значимые статистически достоверные отличия выявлены при изучении маркера Ki-67, экспрессия которого при добавлении в культуру препарата Мэлсмон повышалась в 1,9 раза по сравнению с контролем.

Белок Ki-67– фактор пролиферации, присутствует в ядрах всех делящихся клеток. Уровень экспрессии Ki-67 – информативный показатель для определения интенсивности деления фибробластов кожи. Главной функцией фибробластов является синтез межклеточного матрикса соединительной ткани, основными компонентами которого являются протеины – коллаген, эластин, фибрин и гиалуроновая кислота [11].

При старении клеточной культуры фибробластов также наблюдается активация их пролиферации под действием препарата Мэлсмон. Контрольное значение площади экспрессии Ki-67 на 14-м пассаже составило 1,11±0,2%. В культуре фибробластов на 14-м пассаже площадь экспрессии Ki-67 в группе с введением гидролизата плаценты увеличивалась в 1,7 раза – до 1,84±0,34%. Из литературы известно, что с возрастом наблюдается уменьшение экспрессии ki-67 в фибробластах и других клетках [12], тогда как препарат Мэлсмон стимулирует деление оставшихся в культуре клеток фибробластов человека (рис. 2).

Увеличение относительной площади экспрессии кальретикулина (CALR) под воздействием препарата Мэлсмон свидетельствует об активизации синтетических процессов в культуре фибробластов человека (см. рис. 1). CALR является маркером эндоплазматической сети (ЭПС), а, как известно, этот органоид обеспечивает синтез и модификацию всех белков, синтезируемых клеткой для выведения наружу. CALR является шопероном, в комплексе с кальнексином он участвует в формировании третичной структуры белков. CALR контролирует поток белков и гликопротеинов от ЭПС к аппарату Гольджи, не давая неправильно свернутым молекулам перемещаться в цис-полис аппарата Гольджи [13].

Также CALR обеспечивает регуляцию внутриклеточной концентрации кальция, связывая активными центрами молекулы кальция и удерживая их. Было показано, что содержание кальретикулина в мозге мышей при их старении постоянно снижается. Уменьшение с возрастом содержания кальретикулина приводит к снижению контроля качества белка, что способствует к деструктивным изменениям в процессе старения [14].

На 14-м пассаже не было выявлено статистически достоверных различий между контрольной и опытной группами. Следует отметить, что значение площади экспрессии CALR на 14-м пассаже при введении препарата Мэлсмон (9,84±1,7%) было сопоставимо со значением площади экспрессии в контрольной культуре на 3-м пассаже (10,22±2,2%).

Таким образом, при старении клеточной культуры введение препарата Мэлсмон позволяет замедлить эти процессы.

Данные об усилении синтетической активности фибробластов человека in vitro в группе с введением гидролизата плаценты подтверждаются и увеличением относительной площади экспрессии синтаксина-6 под воздействием препарата Мэлсмон.

Синтаксин 6 (STX6) является маркером аппарата Гольджи. STX6 участвует во внутриклеточной транспортировке везикул, т.е. в транспорте белков. В фибробластах человека STX6 регулирует пост-Гольджи транспорт и доставку компонентов микродоменов мембраны, таких как ганглиозид GM1 (гликосфинголипид) и кавеолин-1, в плазматическую мембрану. Кавеолин-1 участвует в образовании кавеол, которые, в свою очередь, опосредуют мембранный транспорт, эндоцитоз и формирование клеточного ответа на внешний сигнал.

Кроме того, STX6 необходим для ретроградного переноса в тран-полюс аппарата Гольджи гликосфинголипидов, ассоциированных с мембранными микродоменами, и холестерина, полученного из липопротеидов низкой плотности [15].

Статистически достоверные отличия между показателями относительной площади экспрессии в контроле и при воздействии препарата Мэлсмон выявлены на 3-м пассаже – значения составили соответственно 4,39±0,2 и 5,35±0,44% (см. рис. 1).

Аpoptosis inducing factor (AIF) – митохондриальный проапоптозный белок межмембранной локализации с молекулярной массой 62 кДа. AIF запускает путь апоптоза, независимый от каспаз, вызывая конденсацию хроматина и фрагментацию ДНК в клетке. При поступлении апоптотического сигнала происходит транслокация AIF из митохондрии в цитоплазму, а затем в ядро клетки, где он вызывает независимую от каспаз запрограммированную смерть клетки [16].

В нашем исследовании на клеточной культуре фибробластов человека не выявлено статистически достоверных отличий между группами ни на 3-м, ни на 14-м пассаже по площади экспрессии маркера AIF, т.е. препарат Мэлсмон не воздействует на апоптоз в культурах клеток и его применение безопасно.

Значимым является увеличение экспрессии сиртуина-6 на 3-м и 14-м пассажах в культуре клеток фибробластов человека (см. рис. 1, 2).

Рис. 2. Сравнение показателей относительной площади экспрессии сигнальных молекул в культуре фибробластов человека на 14-м пассаже. * p<0,05 по сравнению с соответсвующим контролем

Fig. 2. Comparison of the relative area of signal molecule expression in a human fibroblast culture at the 14rd passage. * p<0,05 compared with the corresponding control

SIRT6 – критический регулятор транскрипции и стабильности генома, теломерной целостности, репарации ДНК и метаболического гомеостаза [17]. Истощение пула SIRT6 приводит к аномальной структуре теломер и потере концевых последовательностей при репликации ДНК, в результате чего наблюдаются нестабильность генома и преждевременное клеточное старение [18].

SIRT6 также играет важную роль в регуляции процессов репарации ДНК. SIRT6 ассоциируется с хроматином, фланкирующим двунитевые разрывы ДНК (DSB), тем самым стабилизируя белки репарации двуцепочечных разрывов ДНК при соединении негомологичных концов (NHEJ) DSB и способствуя эффективной репарации этих разрывов [19]. Было показано, что SIRT6 способствует репарации двунитевых разрывов ДНК через дополнительные механизмы посредством стимуляции резекции ДНК при рекомбинационной репарации разрывов ДНК (HDR) и активации поли-АДФ рибозилтрансферазы PARP-1 для NHEJ и HDR [20].

Рис. 3. Экспрессия SIRT-1 в культуре клеток фибробластов, иммунофлюоресцентная конфокальная микроскопия, ×400, для окраски ядер использовали Hoechst 33258 (синяя флюоресценция). Визуализацию белка проводили с помощью вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor 555 (желтая флюоресценция): а – контроль, 3-й пассаж; б – контроль, 14-й пассаж; в – при введении препарата Мэлсмон, 3-й пассаж; г – при введении препарата Мэлсмон, 14-й пассаж

Fig. 3. Expression of SIRT-1 in fibroblast cell culture, immunofluorescent confocal microscopy, ×400, Hoechst 33258 (blue fluorescence) was used for nuclear staining. Protein imaging was performed using secondary antibodies conjugated to Alexa Fluor 555 (yellow fluorescence): a – control, 3rd passage; b – control, 14th passage; в – with the introduction of the preparation Melsmon, 3rd passage; g – with the introduction of the preparation Melsmon, 14th passage

Площадь экспрессии SIRT6 на 3-м пассаже в контрольной группе 0,59±0,09%, при введении препарата Мэлсмон этот показатель увеличивался в 2 раза (до 1,16±0,08%) (см. рис. 1). Аналогичная тенденция сохранялась и в культуре при старении, площадь экспрессии в группе с добавлением препарата Мэлсмон увеличивалась в 1,7 раза и составляла 0,85±0,09% (см. рис. 2).

Таким образом, применение препарата Мэлсмон при старении культуры клеток фибробластов позволяет добиться увеличения показателей экспрессии сиртуина-6 до таковых в молодой (контрольной) культуре, что отражает его геропротективное действие, обеспечивающее защиту ДНК от повреждений и стабильность генома, позволяя клетке дольше выполнять запрограммированные функции.

Сиртуин-1, еще один член семейства сиртуинов, экспрессируется в ядрах клеток (рис. 3), его считают одним из факторов, определяющих продолжительность жизни у млекопитающих. SIRT1 экспрессируется во всех органах, но преобладает в наиболее энергетически зависимых тканях [21]. Нокаутирующие мутации в гене SIRT1 ведут к пренатальной и перинатальной гибели, нарушениям гаметогенеза, хроническим инфекциям, атрофии поджелудочной железы [22].

SIRT1, как уже отмечалось выше, участвует в различных клеточных процессах, в том числе в репрессии транскрипции в ответ на стресс, ремоделировании хроматина, регуляции дифференцировки клеток, активации метаболических путей.

В нашем исследовании достоверное увеличение экспрессии SIRT1 под воздействием препарата Мэлсмон наблюдалось только на 14-м пассаже. В контрольной группе площадь экспрессии SIRT1 составляла 1,01±0,08%, тогда как в экспериментальной она увеличивалась в 2 раза – до 2,15±0,4%.

Заключение

Проведенные исследования экспрессии ключевых сигнальных молекул, обеспечивающих регуляцию метаболических процессов, внутри- и межклеточные взаимодействия в тканях, показали, что препарат Мэлсмон обладает выраженными геропротективными свойствами по отношению к клеткам кожи человека, что дает основание для его дальнейшей разработки в качестве средства, стимулирующего регенераторные процессы в коже и препятствующего ее старению.

Изучение регуляторных свойств препарата Мэлсмон современными методами молекулярной морфофизиологии показало его несомненную широкую перспективность в качестве потенциального мощного биорегулятора метаболических и физиологических процессов в различных органах и тканях человека как в норме, так и при патологии.

По результатам изложенного сделаны следующие выводы:

• увеличение показателя экспрессии Ki-67 как в молодых, так и в старых культурах свидетельствует об активной пролиферации фибробластов, что in vivo отражает активную регенерацию ткани;
• при введении препарата Мэлсмон в клеточной культуре наблюдается усиление синтетической активности фибробластов человека, что подтверждается увеличением площади экспрессии кальретикулина и синтаксина-6 в группах с введением гидролизата плаценты;
• препарат Мэлсмон активирует экспрессию белков семейства сиртуинов при старении, что обусловливает стабильность генома, защиту клеток от преждевременного старения и обеспечивает выполнение клетками биологических функций.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest

The authors declare no conflict of interest.

1. Banerjee K.K., Bishayee A., Chatterjee M. Anti-inflammatory effect of human placental extract: a biochemical mechanistic approach. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 1992; 14 (6): 361–6.
2. Watanabe S., Togashi S.I., Takahashi N. et al. L-tryptophan as an antioxidant in human placenta extract. J. of Nutritional Science and Vitaminology. 2002; 48 (1): 36–9.
3. Tamura T. A study on the anti-fatigue of the placental extract (Melsmon) and its hormone-like application. Pharmacology and Treatment. 1978; 6 (10): 31–6.
4. Nordlund J.J., Halder R. An analysis of published and other available data. Dermatologica. 1990; 181 (1): 1–4.
5. Kim J.H., Choi S.Y., Kim S.O. et al. Effect of local placental extract injection on pigmentary disorders. Abstracts of the Korean J. of Dermatology. 2005; 43 (2): 175.
6. Kim H.J., Lee J.W., Kim Y.I., Lee M.H. The effect of placental extract on the expression of tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 in SK30 melanoma cells. Korean J. of Dermatology. 2003; 41 (12): 1612–8.
7. http://melsmon.ru/melsmon/istoriyasozdaniya/
8. Коваленко И.И., Аталян А.В. Опыт применения гидролизата плаценты у женщин с климактерическим синдромом в перименопаузе. Гинекология. 2016; 18 (5): 20–5. [Kovalenko I.I., Atalyan A.V. Opyt primeneniya gidrolizata placenty u zhenshchin s klimaktericheskim sindromom v perimenopauze. Ginekologiya. 2016; 18 (5): 20–5 (in Russian)]
9. Измайлова Т.Д. Персонализированные протоколы метаболической коррекции как основа anti-age программ. Инъекционные методы в косметологии. 2016; 1: 24–37. [Izmaylova T.D. Personalizirovannye protokoly metabolicheskoy korrektsii kak osnova anti-age programm. In’ektsionnye metody v kosmetologii. 2016; 1: 24–37 (in Russian)]
10. Измайлова Т.Д. Персонализированная ПРП-терапия. Алгоритм подготовки пациента. Инъекционные методы в косметологии. 2016; 2: 19–23. [Izmaylova T.D. Personalizirovannaya PRPterapiya. Algoritm podgotovki patsienta. In’ektsionnye metody v kosmetologii. 2016; 2: 19–23 (in Russian)]
11. Родионов А.Н., Смирнова И.О., Корнишева В.Г. Дерматология для косметологов. Наука и Техника. 2014; 767. [Rodionov A.N., I.O. Smirnova, V.G. Kornisheva. Dermatologiya dlya kosmetologov. Nauka i Tekhnika 2014; 767 (in Russian)]
12. Ноздрин В.И., Горелова М.В., Белоусова Т.А. Возрастные изменения эпидермиса кожи волосистой части головы у мужчин. Морфология. 2011; 139 (1): 74–81. [Nozdrin V.I., Gorelova M.V., Belousova T.A. Vozrastnye izmeneniya ehpidermisa kozhi volosistoj chasti golovy u muzhchin. Morfologiya. 2011; 139 (1): 74–81 (in Russian)]
13. Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А. и соавт. Определение мутации в гене кальретикулина у пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии. Гематол. и трансфузиол. 2014; 59 (3): 12–5. [Ol’hovskij I.A., Gorbenko A.S., Stolyar M.A., i soavt. Opredelenie mutacii v gene kal’retikulina u pacientov s podozreniem na hronicheskie mieloproliferativnye neoplazii. Gematol. i transfuziol. 2014; 59 (3): 12–5 (in Russian)]
14. Yang S., Liu T., Li S., Zhang X. et al. Comparative proteomic analysis of brains of naturally aging mice. Neuroscience. 2008; 154 (3): 1107–20.
15. Jung J.J., Inamdar S.M., Tiwari A., Choudhury A. Regulation of intracellular membrane trafficking and cell dynamics by syntaxin-6. Biosci. Rep. 2012; 32: 383–91.
16. Daugas E. et al. Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis. J. Exp. Med. 2000; 192 (4): 571–80.
17. Sharma S. et al. Yeast Nop2 and Rcm1 methylate C2870 and C2278 of the 25S rRNA, respectively. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (19): 9062–76.
18. Baur J.A. Resveratrol, sirtuins, and the promise of a DR mimetic. Mech Ageing Dev. 2010; 131: 261–9.
19. McCord R.A., Michishita E., Hong T., Berber E., Boxer L.D., Kusumoto R., Guan S., Shi X., Gozani O., Burlingame A.L., Bohr V.A., Chua K.F. SIRT6 stabilizes DNA-dependent protein kinase at chromatin for DNA double-strand break repair. Aging (Albany NY). 2009; 1 (1): 109–21.
20. Mao Z., Hine C., Tian X., Van Meter M., Au M., Vaidya A., Seluanov A., Gorbunova V. SIRT6 promotes DNA repair under stress by activating PARP1. Science. 2011; 332 (6036): 1443–6.
21. Michishita E. et al. Evolutionarily conserved and nonconserved cellular localizations and functions of human SIRT proteins. Mol. Biol. Cell. 2005; 16 (10): 4623–35.
22. McBurney M.W., Yang X., Jardine K. et al. The mammalian SIR2alpha protein has a role in embryogenesis and gametogenesis. Mol. Cell Biol. 2003; 23 (1): 38–54.

Для цитирования: Кветной И.М., Дробинцева А.О., Клейменова Т.С., Полякова В.О., Туркадзе К.А. Молекулярные механизмы замедления старения кожи под действием гидролизата плаценты человека. Молекулярная медицина. 2019; 17 (2): 50–55. https://doi.org/10.29296/24999490-2019-02-07

For citation: Kvetnoy I.M., Drobintseva A.O., Kleimenova T.S., Polyakova V.O., Turkadze К.А. Molecular mechanisms of retardation of skin aging under influence of human placenta hydrolysate. Molekulyarnaya meditsina. 2019; 17 (2): 50–55 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2019-02-07